Mình muốn tìm hiểu kĩ hơn về sắc kí cột. Bạn nào có thể giúp mình với!!!:hun (
Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất. Dụng cụ: cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia độ, đôi khi bạn cũng không cần cái khóa này nữa, kích thước cột có lớn, có nhỏ, từ bự tổ chảng như cái cột đình đến bé tí tẹo như cái ống tiêm) chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là silicagel pha thuận và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính các nhóm OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng alumin) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí của bạn. Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực của bạn hơn, các chất không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất phân cực hơn sẽ ra sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu của bạn có mà bạn sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó bạn sẽ chọn kích cỡ cột sắc kí của bạn như thế nào. Một yếu tố nữa cũng quyết định đến lượng silicagel là bản mỏng của bạn, tùy thuộc chất bạn tách gần nhau hay xa nhau mà bạn dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra tốt. Nếu trên bản mỏng lượng chất của bạn gần nhau thì lượng silicagel dùng phải gấp 50 lần lượng mẫu, còn xa nhau thì chỉ cần gấp 20 lần là đủ. Dung môi: thông thường bạn chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi, cách chọn dung môi như thế nào là do bạn đã quyết định dựa vào thông tin trên bản mỏng. Chú ý dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy bản mỏng vì hạt silicagel dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một chút. (sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản mỏng, TLC, thin layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để “mò mẫm” thông tin về hỗn hợp của mình cũng như biện pháp tách chất cần lấy). Sau khi có tất cả thông tin rồi thì bạn tiến hành chạy cột. Thực hiện Bước 1 là nhồi cột. Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó trong một erlen chẳng hạn. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy cột để chặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý dùng ít bông gòn thôi. Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì không cần làm việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lần cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột xong chỉ cần vứt bông gòn đi là xong. Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không phân cực) đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel lắng đều, nhớ để 1 erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi cho hết lượng silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa cột lại. Bước 2: nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp mẫu ướt là hỗn hợp của bạn cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào là được. Còn nếu mẫu của bạn không tan trong dung môi chạy cột thì bạn phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1 erlen chẳng hạn. Sau đó dùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình cô quay để cô quay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu. Lúc này nạp hết silicagel đó vào cột và cho dung môi chạy cột vào. Cái này gọi là nạp mẫu khô. Khi cô quay thì nhớ lót miếng bông gòn ở miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên. Cô quay gọi nôm na là chưng cất trong áp suất kém (chân không). Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý không được thay đổi đột ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại quay lại không phân cực, làm như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu, mất hết chất. Bước 4: mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theo chất đã tách được bằng hũ bi, mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ (mỗi hủ bi chứa được khoảng 50-200mL tùy kích thước lớn nhỏ). Sau đó đem chấm bản các hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn. Ghi chú Mỗi lần tách cần khoảng 50-200 hủ bi, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày. Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này quyết định quá trình tách của bạn có tốt hay không. Nếu thận trọng quá cho chạy chậm thì bạn phải chờ lâu, nếu nôn nóng quá cho chảy nhanh thì silicagel của bạn chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy cũng không tách được. Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống nhanh thì bạn dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá). Nó sẽ sục không khí vào để tăng tốc quá trình đẩy dung môi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới khoảng 3 giọt/phút). Chú ý chất của bạn không dễ bị oxi hóa thì mới dùng phương pháp này được. Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết chất của bạn. Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm, nhưng nhược điểm là bạn phải ngồi canh nó liên tục, tức là nếu tách 3 ngày thì bạn phải thức trắng 2 đêm để canh cột! CHú ý khi đã chạy pha đảo thì không được dùng máy đẩy, vì bản chất pha đảo là chậm (giống như chạy ngược chiều sợ công an thổi thì ai cũng phải chạy chậm, sợ bị tông nữa). Nếu dùng máy đẩy thì như đã nói ở trên, silicagel không tách được, quá trình tách của bạn hoài công. Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu. Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì bạn phải khóa cột lại ở cuối ngày để đi về, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu để quá lâu thì chất bị giữ lại trong cột lâu sẽ khó tách ra hơn.
Kiến thức còn hạn hẹp, nói hơi khó hiểu nhưng hy vọng đóng góp được chút ít. Thân!
mình cảm ơn nhiều nhé ! Nhưng mình đang chuẩn bị chạy cột trên alkaloid từ cây dừa cạn ( catharanthus roseus) bạn có lời khuyên hay tài liệu nào ko ?
ban Moderator ơi cho mình hỏi nếu dùng sắc kí cột để tách chất nhưng mình muốn dùng kiểu sắc kí cột liên tục tức là liên tục nạp dung dịch cầnn tách và liên tục lấy hỗn hợp tách ra (dùng thêm máy bơm pittong nữa) rồi cho đi qua máy đo UV- VIS để xác định pic. mình có ý tưởng nhưng chưa lắp ráp được thành hệ hoàn chỉnh.có điều chưa chọn được dung môi cho pha động. vì chất mình cần tách la C21H18O12 khối lượng phân tử lớn có chứa nhiều vòng benzen và trong dung môi etanol nên mình băn khoăn về chọn thành phần pha động như thế nào lắm. cần lời khuyên. cảm ơn nha
Ý tưởng của bạn giống với 1 máy HPLC điều chế ! Với hệ thống này thì bạn lấy cao hòa tan dung môi, máy sẽ tự động lấy mẫu, tiêm, bơm, ra phân đoạn và bạn chỉ việc cô quay đuổi dung môi thu chất. Ở ngoài đời thật thì mình cũng đã thấy hệ thống này, tuy nhiên tính rủi ro cao hơn vì bạn khó mà xác định, hay nói khác hơn là chỉ chính xác cho cái máy nó phải làm gì. Nếu gắn thêm đầu dò UV-VÍ nữa thì sự việc cũng phức tạp lên, vì nó liên qua đến cái cột truyền thống, phải chỉnh sửa chút ít. Cuối cùng, chất bạn cần tách không phải quá phức tạp, 21C và vòng benzen, mình chỉ quan tâm nó có phân cực hay kém, dung môi ethanol vẫn là dung môi đầu, còn ở bước sơ khởi. Rất vui được trao đổi thêm Thân!